[ 연구실 일지 / Mar ] 단백질 연구를 위한 실험 기법 네 개를 배웠어요

오늘로서 FPEL에 5일차 출근을 했습니다.
지금까지 단백질 연구를 위한 실험 기법 네 개를 배웠고, 사수님께서 최근 쓰신 논문을 공부했고, 랩미팅도 한 번 참여했어요!!
 

Com Cell 은 Competent Cell의 줄임말,
람다(λ)는 표준 단위인 μℓ (microliter)의 현장 용어입니다.
OD600 값은 600nm 파장의 빛을 배양액에 쏘았을 때, 얼마나 많은 빛이 세포에 가로막혀 흡수되거나 산란되는지를 측정하는 것입니다. 간단히 말해 "우리 배양액 안에 세포(세균)가 얼마나 빽빽하게 들어있는지"를 숫자로 나타낸 지표입니다.
2xYT는 미생물(주로 E. coli)을 아주 배불리 먹여서 고농도로 키울 때 사용하는 영양 만점 배지입니다.

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[1] E.coli Transformation (대장균이 단백질을 발현하도록 DNA 정보를 주입시키자)

(1) Transformation

1. Transformation할 균(Com cell)을 준비한다. (Electroporation, Heat-shock해서 준비시키거나 키트 이용해서 처리된 cell)
- 이번 실험에선 −80°C에 얼려놨던 TOP10 Com Cell을 Ice bucket에서 3분간 해동했다.
2. −20°C에 얼려놨던 Vector DNA도 상온 랙에서 녹인 후, 가볍게 Vortexing 및 Spin-down 하여 준비한다.
3. 항상 컨탐 안되게 조심한다 (알코올 뿌린 휴지로 바닥 닦고 알코올 램프 준비)
4. 피펫 팁을 화염 멸균한 뒤, Vector DNA 1 μl (=1 λ)를 Com cell에 첨가한다.
5. 첨가 후 세포 손상을 방지하기 위해 형질전환된 세포가 있는 microtube를 Vortexing 하지 말고, Pipetting을 통해 부드럽게 혼합한다.
 

(2) 고체배지에서 배양

1. 경험적으로 30 μl가 콜로니가 적당히 잘 뜨므로 배지 위에 세 지점으로 나누어 떨어뜨린다.
2. 스프레더(Spreader)를 이용해 배지를 왼손으로 회전시키며 오른손으로 얇고 고르게 펴 바른다. 배지 표면의 물기가 완전히 사라질 때까지 약 1분간 반복한다. 이 작업도 불 근처에서 컨탐 안되게 조심해서 한다.
3. 도말이 완료된 배지는 수분 응결 방지를 위해 뒤집어서 37°C 인큐베이터에 16시간 배양한다.

배양 결과물 !!! 이건 너무 빼곡히 자란거라고 하셨당...ㅜ 확인 후 재빨리 4도씨로 보관 장소 옮겨서 성장 저해했다!

 

[2] Cell Overexpression

(1) Pre-culture (액체배지로 옮겨서 배양)

0. 알코올 램프를 준비한다. 알코올도 미리 에탄올 분주해서 채워놓는다.
1. Serological Pipette으로 액체배지 10미리를 따서 컬럼에 담는다. 액체배지는 병입구와 뚜껑을 화염멸균한다.
2. 컬럼에 1000x Amp을 10람다 넣어서 1000x를 유지시킨다.

3. 3미리씩 세 컬럼에 옮겨담고 볼텍싱한다.

4. 대장균이 키워진 배지에서 콜로니 하나 있는 거 찾아서 콕 피펫으로 살짝 뜬 후 액체배지 담긴 컬럼에 이젝션한다. (Colony Picking)

쉐이킹 중이라 사진 흔들림!

 
5. 뚜껑 닫아서 37도씨 쉐이킹 인큐베이터에 16시간 배양한다.

기기 예약 잊지 말기!

 

(2) Main-culture (큰 액체배지에서 배양)

1. 500mℓ 이상 삼각 플라스크를 준비한다.
2. 50mℓ짜리 세롤 피펫으로 4번 액체배지를 옮겨담아 플라스크에 총 액체 배지 200mℓ를 넣어야 한다. (컨탐은 늘 조심하자)
3. Ampicillin 1000x가 되도록 200μℓ를 첨가한다. (배지가 200mℓ니까 10^-3되게 하려면 200μℓ, 즉 290λ 넣어주면 됨!)
4. 30mℓ 배양해놓은 프리컬쳐한 균 컬럼에 담겨있던 200짜리 피펫팁을 1000짜리 피펫팁으로 끼워서 함께 버린다.
5. 1000짜리 피펫팁을 화염멸균 하고, 배양된 액체배지가 가라앉은게 없도록 피펫팅을 잘 해서 잘 섞어준다.
1mℓ씩 = 1000μℓ 씩 총 2번 해서 2mℓ를 플라스크 본 배지에 넣는다. (1/100 희석)
6. Shaking incubator(200 rpm, 37°C)에 2.5시간 배양한다.

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[3] OD 600 값 측정하기

OD값으로 세포 성장 상태를 확인한다. 0.5에 도달했으면 37도씨에서 말고 23도씨에서 20시간 더 키울 거다.
(세포마다 성장 속도가 다르므로 OD 값 확인은 필수다. OD값이 0.4~0.6에 도달했을 때 Induction을 시작해야 한다.)

(1) Cell 따기

1. 돌려지고 있는 인큐베이터 뚜껑을 열면 천천히 멈춘다. 플라스크 뚜껑을 열고 200람다를 딴다.

(2) 플레이트에 옮겨담기

1. 96-well 플레이트를 준비해서 한 칸에 대조군(Blank)으로 2xYT 배지 200μℓ를 분주한다. (blank 대조군)
2. 인접한 칸들에 각각 배양 중인 시료(Sample)를 200μℓ씩 분주한다. (실험군)

3. Gen5 시스템을 켜서 protein concentration 선택한다. 그러고 (사진 속 프로도가 있는) 버튼을 눌러서 찍을 칸들을 다 눌러준다.

4. (사진 속 어피치가 있는)  버튼을 눌러서 2xyt가 든 blank 칸을 누르고 샘플 칸들을 누른다.

5. 플레이트의 알파벳열 a 쪽이 오른쪽 위를 향하도록 기기에 삽입한 후 OD600값을 측정한다.

6. 기기 설정에서 'Corrected' 옵션으로 바꿔서 Blank 값은 0으로 보정하고 샘플의 순수 흡광도 값을 산출한다.
 

[4] Induction

(1) BI 채취

1. OD600 값이 0.4~0.6에 도달했으면 BI(Before Induction) 샘플을 따서 마이크로튜브에 넣는다.
2. 마이크로튜브를 13000rpm에서 1분 centrifuge한다.
3. 끝나면 액체 배지는 털어서 버리고 피펫으로 가라앉은 셀 주변에 액체배지까지 말끔히 따서 버려준다. (자라지 않게 영양 공급 차단하는 것임.)
4. 4도씨 냉장고에 보관한다.

(2) Inducer 넣기

1. Arabinose 와 같은 Inducer를 넣어준다.

pBAD System 은 L-Arabinose가 존재할 때 유전자 상단의 루프 구조가 해제되며 타겟 단백질이 과발현되는 원리를 이용한다.
이 시스템 외에도 Lactose 유사 구조인 IPTG를 사용하여 pET 계열 등 다른 프로모터 시스템을 제어하는 IPTG Induction 시스템도 있다.
우리 연구실은 Arabinose, IPTG를 주로 쓴다.

2. 100x AraB이므로 200μℓ를 넣어준다. (전체가 2mℓ이므로)
3. 23도씨에서 20시간 더 키운다.

다른 실험에서는 Arabinose를 2배의 양을 넣었다. 왜냐하면 ? Dual Vector System (pBAD Promoter를 가지는 발현용 벡터 & OTS 벡터가 Com Cell에 동시 존재)을 사용했기 때문이다. 두 벡터가 Arabinose 자원을 나누어 써야 하므로 AraB에 반응하는 두 pBAD 프로모터가 잘 반응하도록 2배 농도로 넣어줬다.
그리고 이후 Co-transformation시켜 각 벡터의 저항성에 맞는 두 종류의 항생제를 병용함으로써, 두 벡터가 모두 성공적으로 도입된 개체만을 선택적으로 선별한다.

다른 실험에서는 이 때 Inducer와 함께 Syringe Filter로 여과해 불순물을 제거한 비천연 아미노산 AzoF (N 세개가 일렬로 붙여진 페닐알라닌)를 도입했다. 왜냐하면 ? Orthogonal Translation System (OTS)을 사용했기 때문이다. 이 시스템은 세포의 기존 translation 시스템을 건드리지 않고, stop codon(UAG)에 비천연 아미노산(UAA)을 넣는 orthogonal tRNA/synthetase pair를 이용해 특정 위치에 넣어서 비천연 아미노산을 인위적이고 의도적으로 삽입하는 기술이다.
기존 synthetase → 기존 아미노산만, OTS synthetase → UAA만
이렇게 간섭이 없기 때문에 orthogonal 이라는 말이 붙는다.

정상 mRNA 구조
AUG (start) — codons — codons — STOP (UAA / UAG / UGA)

OTS 사용할 때
AUG — codons — ⭐UAG (삽입 위치) — codons — 진짜 STOP (UAA)

이렇게 mRNA에 stop codon 자체는 여러 개 있을 수 있으나 중간에 넣은 UAG에 OTS tRNA와 release factor (RF) 두 가지가 경쟁해 누가 먼저 붙느냐에 따라 성공(비천연 아미노산이 삽입된 full-length 단백질)인지 실패(truncated 된 짧은 단백질)인지 결과가 결정된다. 그래서 SDS-PAGE 결과를 보면 OTS tRNA 농도, synthetase 성능, UAA 공급, release factor 경쟁, UAG 위치 (구조 영향)에 따라서 밴드가 위(full-length protein), 아래(truncated protein) 이렇게 나온다.

(3) AI 채취

1. 20시간 키운 뒤 induction된 cell을 채취하려고 한다.
2. OD 600 값을 재는 기계가 1.0이 최대 측정치라서 배지를 희석해서 OD 값을 측정해야 한다. 따라서 원래 5.0인 cell이라면 샘플을 1/5로 5배 dilution해서 1.0 이하로 측정해 유추해야 한다.
3. BI, AI Cell 수 맞추기 (추후 PAGE 돌리기 위함) : 0.5에서 1mℓ 채취한 BI 샘플의 Cell 수와 AI 샘플의 Cell 수를 같게 하기 위해선 1.0에서 0.5mℓ, 즉 500μℓ가 필요하다.

[5] Cell Harvest

1. PAGE Gel 상에서 밴드 두께를 정확히 비교하기 위해, 세포 농도(Cell density)에 비례해 Normalization한다. (시료 양을 조절함으로써 타겟 단백질의 상대적 함량을 맞춘다.)
3. 400mℓ 배양액을 50mℓ Centrifuge bial 8개에 나눈다. 이 때 25mℓ씩만 넣고 저울에 얹은채로 DW 채우면서 반대편의 두 개씩의 무게 균형(Balance)을 맞춘 후, 기기에 넣고 Centrifuge(13,000 rpm에서 1분)한다. 이후 상등액(배지)를 최대한 제거해 cell pellet만 남긴 후 나머지 25mℓ씩도 마저 그대로 다 넣는다. 이렇게 두번씩 나눠 넣는 이유는 50mℓ를 다 넣으면 centrifuge 과정에서 터지거나 잘 안 되기 때문에 max 30-40mℓ만 넣는 것이다.

4. 상등액을 최대한 제거해 Pellet만 남긴다.
5. 어차피 나중에 lysis(파쇄)해서 단백질만 쓸 거라면 4°C에 냉장 보관하고, 해동 후 다시 키울 거라면 화염 근처(Aseptic condition)에서 작업 후 Glycerol(부동액)을 넣어 -80°C 초저온 냉동고에 급속 보관한다.

왜??? 그냥 얼리면 세포 안의 수분이 날카로운 얼음 결정이 되어 세포막을 다 찢어놓는다(세포 사망).
글리세롤은 일종의 부동액 역할을 해서 얼음 결정을 둥글게 만들거나 형성을 방해해 세포가 얼어도 터지지 않게 보호한다.

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[6] 최적화 조건 비교

온도 및 시간, 단백질의 Purity, Overexpression 정도, 잡밴드(Non-specific band) 여부 등 발현 양상을 비교해 배양 조건을 분석하고 최적의 단백질 생산 조건을 확립한다.

조건	배양 온도	배양 시간	비고
Condition A	37∘C	6시간	고온 단기 발현 (Inclusion body 형성 확인)
Condition B	23∘C	20시간	중온 중기 발현 (Solubility 최적화)
Condition C	18∘C	24시간	저온 장기 발현 (안정성 극대화. 단백질의 solubility를 높이는 데 도움)

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[7] SDS-PAGE (단백질 크기를 확인해보자)

1차적으로 target protein의 크기를 확인하는 과정이다. 
 
* SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) *
- 음이온성 계면활성제(Detergent).
- 단백질의 소수성(hydrophobic) 영역에 결합해 입체 구조를 파괴하고 긴 사슬로 푼다.
- 단백질 고유의 전하를 없애고, SDS가 붙어 크기에 비례하는 강한 음전하를 띠게 한다.
- 결과적으로 단백질이 오직 분자량(질량)에 의해서만 이동하게 만든다.

(1) Gel 만들기

1. 실제 단백질이 크기별로 분리되는 층(Running Gel 또는 Resolving Gel)과 단백질 샘플을 일렬로 모아주는 상단 층(stacking gel)을 만든다.
2. 먼저 Bio-Rad 캐스팅 프레임을 수평이 되게 초록색 홀더에 끼우고, 유리판 사이의 간격이 일정한지 확인한다. 투명 통에는 회색 긴 스펀지를 끼우고 집게는 밀착되게끔 피펫팁을 끼운다.
3. 유리판 사이에 DW를 채워 새는 곳이 없는지 확인하고, 확인 후 DW를 완전히 비워낸다.
4. 50mℓ conical tube에 R, S 라벨링하고 각 튜브에 아래 순서대로 serological pipette을 이용해 시약을 넣는다.
(Acrylamide는 독성이 있으므로 마지막에 투입한다.)

• R-Gel (12%, 20ml 기준): DW 6.8ml → 1.5M Tris(pH 8.8) 5.0ml → 30% Acrylamide 8.0ml
• S-Gel (5%, 7.5ml 기준): DW 4.3ml → 0.5M Tris(pH 6.8) 1.88ml → 30% Acrylamide 1.25ml

5. 냉동고에서 10% APS를 꺼내 가볍게 vortex하고 spin down한다.

• R-Gel: APS 200μℓ 투입 후 TEMED 8μℓ 추가.
• S-Gel: APS 75μℓ 투입 후 TEMED 7.5μℓ 추가. 

6. APS와 TEMED를 넣으면 굳기 시작하므로 신속히 다음 단계로 넘어가 작업하도록 한다.
 

(2) Molding에 GEL 넣어 굳히기

1. 통에 물기를 완전히 티슈로 최대한 닦아내고 TEMED를 넣어서 vortexing한다.
2. serological pipette을 이용해 유리판의 초록색 선까지 빠르게 넣어준다.
3. 젤 윗부분이 마르지 않고 평평해지도록 100% 에탄올을 끝까지 채운다.
4. 1시간 정도 방치하여 굳힌 후, 에탄올을 따라버리고 남은 물기를 티슈로 꼼꼼히 닦아낸다.
5. APS/TEMED를 넣은 S-Gel 용액을 섞어 유리판 끝까지 가득 채운다.
6. 기포가 생기지 않도록 주의하며 Comb을 끼우고 30분간 굳힌다.
 

(3) 보관하기

1. 티슈를 잘 펴놓고 3차 증류수로 적신다.
2. 굳은 젤은 유리판+Comb째로 꺼내어, 3차 증류수에 적신 티슈로 감싼다.
3. 수분이 날아가지 않게 크린랩으로 밀봉하여 통에 담아 4°C 냉장고에 보관한다.
4. 라벨링한다. 15well, 3ea, 12%(acrylamide), date

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PAGE 전에 Cell Lysis하는 과정은 아직 못 봤습니다. 보통은 수확한 cell pellet을 Lysis Buffer에 넣고 파이펫팅으로 잘 풀어준 다음, 주로 두 가지 Lysis 방법을 쓴다고 합니다.

• Sonication (초음파 파쇄): 초음파를 쏴서 물리적으로 세포를 터뜨림. (귀마개 필수!)
• Chemical Lysis: Lysozyme 같은 효소나 계면활성제를 넣어 화학적으로 녹임.

그러고 나서 Centrifugation으로 깨진 세포 껍데기(찌꺼기)와 우리가 원하는 단백질이 녹아있는 액체(상등액)를 분리한다고 합니다. 이 때 Soluble fraction (상등액)에 단백질이 잘 녹아있으면 성공, 반면에 Insoluble fraction (침전물)에 단백질이 뭉쳐서 가라앉으면 실패라고 해요.(Inclusion body 형성)
 
단백질이 왜 isoluble fraction에 있으면 실패인지, 단백질 특성에 따라 다른 건지도 궁금하지만 이건 앞으로 더 공부해볼 부분이네요. 아는 언니에게 단백질 정제 실험에 대해 얼핏 들었던 바로는 이런 aggregation이 실험 때 아주 빈번히 일어나서 이걸 잡는게 중요하다던데... 사수님께 요부분을 배울 생각에 아주 설렙니당...
아 그리고 page gel 만든걸로 run하는 부분도 아직...!