단백질을 잘 키워준 대장균님 고마워요. 수고하셨으니 이제 세포벽을 허물고 내부의 단백질을 용액 상태로 추출해서 자유를 드릴게요.
[1] 세포 파쇄하기
1. 준비물
① 냉동된Cell Pellet in microtube ② 냉동된 Lysozyme 200 µl ③실온 보관된 Lysis Buffer(pH 8.0) 10ml ④ice bucket (세포파쇄기에 들어갈 작은 크기로, 얼음 가득, 물 뿌려서 준비)
얼음 꽉꽉 채우고 DW도 채우기!
Sonication 시 열이 많이 발생하므로 아이스버킷에 물을 섞어 냉각 효율을 높이는 것이 단백질 구조 유지에 결정적. 온도 제어는 실험 성공을 위한 핵심 포인트! 단백질 변성 방지를 위해 아이스버킷에 물을 채워 밀착 고정한다. buffer는 항상 차갑게! 프로틴은 항상 찬 게 좋다.
2. 재현탁 (Resuspension)
① Serological Pipettte 사용해 Lysis Buffer를 10ml 튜브에 분주.
②튜브 뚜껑 잘 닫고 꾹 눌러 vortex. 1분간 강하게 하여 펠렛을 완전히 흩뜨리자.
3. 효소 처리
① 50x Lysozyme을 200µl씩 첨가한 후, 5초간 vortex.
10ml짜리에 1x로 넣으려면 50x는 1/50 해야하므로 10ml/50=200µl 넣어주는게 맞다. 볼텍싱은 잘 섞여서 세포벽 분해를 촉진하게 하기 위함이다. 만약 용액이 없어서 50x Lysozyme을 만들어야 한다면? lysozyme powder 0.1g을 저울에서 맞춘 후 DW 2ml와 튜브에 넣고 vortex해서 전부 녹여지면 syringe filter로 여과해서 소분해놓고 쓰면 된다. 주사기로 눌러주면 내려간다. 내려간 용액 받기.
① 사용 전 팁을 킴텍스+DW or ethanol로 팁을 닦아 청결을 유지한다. ②팁을 튜브 정중앙에 놓고 제물대를 조정해 튜브와 팁의 간격이 0.5cm 정도 되도록 해서 고정한다.
팁 크기는 큰거로 해도 경험적으로 단백질 영향 없어서 괜찮다고 하셨으나 셀에 맞춰 경우에 따라 작은 팁으로 바꿔 써야 한다.
③ 기기를 세팅한다. - 시간 3분 20초 - Pulse 01/02 - 온도 (그냥 놔두기) - 강도(Amp1) 28%
사수님 기기 설정 프로토콜은 경험적 결과다. 3초 사이클(1초 작동, 2초 휴식)이니까 총 10분 중 3분 20초는 일하고 6분 40초는 쉰다. 계속 하면 열 땜에 망가질 수 있으므로 쉬는 시간이 필요해서 주는 것. 다 되면 열 식히게 10분 그대로 놔둔다. 그래서 20분이 한 턴이다. 이렇게 총 50분(20분-20분-10분 간격)을 돌린다.
④얼음이 녹으면 높이가 변해 튜브가 움직이므로 첫 20분 작동 후 & 그 다음 20분 작동 후 제물대를 간격을 다시 줄인다. ⑤ 50분이 끝나면 팁에서 튜브를 빼서컬럼 뚜껑을 닫아준다. ⑥기기 동스라미 버튼을 눌러서 전원을 끈다. ⑦ 사용 후팁을 킴텍스+에탄올로 닦고말리기 위해 문을 살짝 열어둔다.
[3] 원심분리하기
파쇄된 세포 부스러기(Pellet)와 우리가 원하는 단백질 용액(Soluble fraction)을 분리해보자. 0. 미리 Temp 꾹 눌러서 컬럼 옮겨담기 전에 4도씨로 맞춰놓아야 한다. ① 센트리 돌리기 전에 저울을 이용해 튜브 간 무게를 동일하게 맞춘다. (밸런싱 : Balancing용 튜브에 DW 이용해서 채워 무게 맞춘다) ② 13,000 rpm에서 10분간 centrifuge한다.
원심분리 기기전원버튼 오른쪽 사이드에 있음!
③ 원심분리 후 위의 맑은 액체(Soluble fraction)만 새 컬럼에 옮겨 담는다. ④ 20ul 따서 보관한다. (나중에 페이지 결과 분석 때 실험 어느 단계에서 문제 발생했는지 파악하기 위함.)
[4] 레진 결합하기
① 단백질의 His-tag과 니켈 레진이 결합하도록 유도한다. (이러면 타겟단백질의 N-term에 레진이 붙는다.) ② Ni-NTA 레진을 1분간 볼텍싱해 균일하게 잘 풀어준다. ③ 각 튜브에 레진을 300µl씩 넣는다. ④ 4°C 로테이터에서 1시간 동안 반응시킨다.
[5] 단백질 정제 (Filtration, Washing, Elution, Desalting)
니켈에 약하게 붙어있던 불순물 단백질을 씻어내고 순수한 타겟 단백질만 뽑아내자. 주의 ! 이제부터 20ul씩 따서 단계별로 보관할거다. (나중에 페이지 결과 분석 때 실험 어느 단계에서 문제 발생했는지 파악하기 위함.)
1. Filtration
① 컬럼(시린저+Membrane)을 준비한다. ②수돗물로 멤브레인을 흠뻑 적셔 흐르게 한다. 마지막엔 DW로 흠뻑 적셔내려준다.
③ 시린저로 공기를 주입해 잔여 수분을 제거한다. ④ 받아낼 통을 밑에 준비해놓는다. ⑤반응시킨 용액을 컬럼에 붓는다. ⑥벽면에 붙은 레진까지 탈탈 털어 넣어야 수율이 좋아지므로, 흐르는 액체로 벽면을 헹궈 다시 로딩한다. (수율 확보를 위해레진 300µl가 유실되지 않도록 마지막 한 방울까지 컬럼 멤브레인 위로 모으는 것이 중요하다)
2. Washing
①Washing Buffer(낮은 농도의 Imidazole)를 컬럼 선까지 채운다.
다른 히스티딘 단백질도 레진에 붙었을 수 있으므로 워싱해서 타겟 프로틴만 남도록 하기 위한 단계다. 이미다졸은 레진 결합 competitor이라서 적당히 넣으면 잡단백질은 떨어지고 타겟단백질은 레진에 붙어있다. (왜???) 워싱을 할 땐 피펫팅으로 멤브레인 가까이 골고루 워싱해야 한다. 워싱을 잘 해야 타겟 프로틴만 정제되므로 아주 중요한 과정이다.
②워싱 버퍼를 컬럼 선까지 넣는 과정을 세 번 반복하며피펫팅을 통해 레진 사이사이의 불순물을 꼼꼼히 씻어낸다. (워싱 시 피펫팅을 너무 세게 하면 레진이 상할 수 있고, 너무 대충 하면 불순물이 남으니 주의해야 한다.)
③ 다 내려갈때까지 기다려주기
④ 3번째 워싱 때 마지막 나오는 물을 샘플용으로 받아놔야 한다. ⑤단계 마지막엔 항상 시린저로 공기를 압력으로 깔끔히 액체를 빼주어야 한다.
3. Elution (용리)
① Elution Buffer(높은 농도의 Imidazole)를 넣어 결합해 있던 레진에서 단백질을 다 떨어뜨려 최종 회수할거다.
② 25ml 튜브로 기둥을 세워 지렛대를 두개 쌓고 아래에 단백질을 받을 튜브를 놓는다.
③ 총 2.5ml의 elution buffer를 1ml, 1ml, 0.5ml씩 나눠서 피펫팅하며 넣어준다.
④잘 안 내려가면 시린저로 뚫어주면서 받아준다.
⑤ 내 타겟단백질은 GFP-MMP9 Cleavage 4D5 ScFV였기 때문에 elution 전엔 멤브레인에 형광이 있었지만 elution 후 받아낸 튜브에 형광이 있는 걸 볼 수 있었다.
다 하면 이렇게 멤브레인에 남음
Imidazole 농도가 아주 높은 버퍼를 쏟으면 레진에서 타겟단백질의 N-term이 다 떨어지고 이미다졸이 다 붙는다.
4. Desalting (탈염)
Size exclusion chromatography mechanism (SEC)
PD10 컬럼 내부에는 아주 미세한 크기의 구멍이 뚫린 비드들이 가득 차 있다. 단백질은 크기가 커서 비드 사이의 틈을 타고 빠르게 내려오고, 이미다졸은 크기가 매우 작아서 비드 속 미세 구멍들을 오가며 천천히 내려온다. 결과적으로 단백질이 먼저 내려오고, 소금(이미다졸)이 나중에 내려오며 분리되어서 Desalting이라 부른다.
①PBS 컬럼을 준비한다.
②PBS 컬럼이 충분히 녹아내렸으면 위에 용액을 붓는다.
③다 내려갈 때까지 기다린다.
④ 기다리는 동안 단백질 받을 용기를 라벨링한다.
⑤ 단백질 받을 큰 튜브에 파란 뚫린 뚜껑 닫고 위에 작은 튜브를 얹는다. 1ml씩 총 3ml의 PBS를 넣어서 컬럼에 높은 농도의 순수 단백질을 받는다.
⑥ 뒷정리 : 시린저는 물로 헹궈내주고 에탄올 뿌려준 뒤 에어건(초록 손잡이 돌려서 on/off)으로 말려준다. PD10 컬럼은 buffer로 두 번 내려가도록 기다려주면 된다.
Binding : 타겟 단백질에 달린 His-Tag(히스티딘 택)의 질소 원자가 니켈과 결합함. Washing : 히스티딘의 Side chain(곁사슬) 구조와 아주 유사한 구조를 갖는 Imidazole을 약한 농도로 넣어줌 (As a competitor). 그러면 타겟 단백질만큼은 강하게 결합하지 않았던 약한 결합하는 불순물 단백질들을 Imidazole이 밀어내고 니켈 자리를 빼앗음! Elution : 타겟 단백질의 결합력보다 훨씬 강하게끔 압도적 수의 Imidazole을 넣어줘서 타겟 단백질이 밀려나오도록 공격함.구조가 매우 유사하죠?
