[ 연구실 일지 / 실험 1 ] SDS-PAGE : 정제한 단백질 크기 확인 프로토콜

PAGE란?

1차적으로 target protein의 크기를 확인하는 과정이다. 
 
* SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) *
- 음이온성 계면활성제(Detergent).
- 단백질의 소수성(hydrophobic) 영역에 결합해 입체 구조를 파괴하고 긴 사슬로 푼다.
- 단백질 고유의 전하를 없애고, SDS가 붙어 크기에 비례하는 강한 음전하를 띠게 한다.
- 결과적으로 단백질이 오직 분자량(질량)에 의해서만 이동하게 만든다.

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[1] Loading Sample 만들기

1. Protein Dye 재료 배합

① 5X Loading dye 180λ + DTT(10X) 20λ를 섞어 총 200λ mixture를 만든다.

• DTT 역할 (Dithiothreitol): S-S bond(이황화 결합)를 절단하여 단백질의 3, 4차 구조를 1차 구조로 변성시킨다.

② Vortex 후 짧게 centrifuge(약간) 한다.

 

2. 단백질-Dye 배합

① Target 정제 단백질을 microtube에 20λ씩 넣는다.

② 각 Tube에 Dye를 5λ씩 넣고 피펫팅으로 섞어준다. (5X dye 농도 유지, 5/25=5X) (작은 용량이므로 피펫팅 오류가 발생하지 않도록 주의한다.)

 

3. Cell pellet-Dye 배합

① B.I(Before Induction) & A.I(After Induction) cell pellet에 PBS 5λ, 8M Urea 5λ, dye 2.5λ씩 넣는다.

Urea 역할
1. 강한 Chaotropic agent로 수소결합을 파괴해 단백질을 변성시킨다 (SDS보다 깊이 침투).
2. Protease(단백질 분해 효소) 억제.
3. Inclusion body나 막단백질 같은 소수성 결합 물질을 녹이는 데 도움을 준다.

② Vortex 후 짧게 centrifuge(약간) 한다.

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[2] 단백질 결합 풀어주기

1. Denaturation by Heating (가열에 의한 변성)

① Heat block(가열 기기)을 95℃로 설정한다.

② Cell(2개) + target protein(정제된 것 5개, 23℃·18℃ 조건) 등 대조군 포함 총 14개를 넣고 5분간 가열한다.

Carbamylation (카바밀화) 주의 !
- 고온에서 Urea가 분해되어 생기는 이소시안산(Isocyanic acid) 부산물이 단백질과 결합하여 성질을 변화시키는 화학 반응이다.단백질 전하를 (+)에서 중성으로 바꾸어 Charge-to-mass ratio를 미세하게 변화시킨다.
- 이로 인해 Smearing(밴드가 선명하지 않고 뿌옇게 번지는 현상)이 발생할 수 있다. 95℃에서 5분 가열은 카바밀화가 격하게 일어나기엔 짧은 시간이지만, 밴드 경계가 조금 흐려질 수는 있다.

③ 가열 후 뚜껑 등에 맺힌 수증기 방울들을 centrifuge로 천천히 5초간 돌려 모두 내려준다.

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[3] PAGE Gel 만들기

1. Gel Prep

1. 실제 단백질이 크기별로 분리되는 층(Running Gel 또는 Resolving Gel)과 단백질 샘플을 일렬로 모아주는 상단 층(stacking gel)을 만든다.
2. 먼저 Bio-Rad 캐스팅 프레임을 수평이 되게 초록색 홀더에 끼우고, 유리판 사이의 간격이 일정한지 확인한다. 투명 통에는 회색 긴 스펀지를 끼우고 집게는 밀착되게끔 피펫팁을 끼운다.
3. 유리판 사이에 DW를 채워 새는 곳이 없는지 확인하고, 확인 후 DW를 완전히 비워낸다.
4. 50mℓ conical tube에 R, S 라벨링하고 각 튜브에 아래 순서대로 serological pipette을 이용해 시약을 넣는다. 
(Acrylamide는 독성이 있으므로 마지막에 투입한다.)

• R-Gel (12%, 20ml 기준): DW 6.8ml → 1.5M Tris(pH 8.8) 5.0ml → 30% Acrylamide 8.0ml
• S-Gel (5%, 7.5ml 기준): DW 4.3ml → 0.5M Tris(pH 6.8) 1.88ml → 30% Acrylamide 1.25ml

5. 냉동고에서 10% APS를 꺼내 가볍게 vortex하고 spin down한다.

• R-Gel: APS 200μℓ 투입 후 TEMED 8μℓ 추가.
• S-Gel: APS 75μℓ 투입 후 TEMED 7.5μℓ 추가. 

6. APS와 TEMED를 넣으면 굳기 시작하므로 신속히 다음 단계로 넘어가 작업하도록 한다.
 

2. Molding에 GEL 넣어 굳히기

1. 통에 물기를 완전히 티슈로 최대한 닦아내고 TEMED를 넣어서 vortexing한다.
2. serological pipette을 이용해 유리판의 초록색 선까지 빠르게 넣어준다.
3. 젤 윗부분이 마르지 않고 평평해지도록 100% 에탄올을 끝까지 채운다.
4. 1시간 정도 방치하여 굳힌 후, 에탄올을 따라버리고 남은 물기를 티슈로 꼼꼼히 닦아낸다.
5. APS/TEMED를 넣은 S-Gel 용액을 섞어 유리판 끝까지 가득 채운다.
6. 기포가 생기지 않도록 주의하며 Comb을 끼우고 30분간 굳힌다.
 

3. 보관하기

1. 티슈를 잘 펴놓고 3차 증류수로 적신다.
2. 굳은 젤은 유리판+Comb째로 꺼내어, 3차 증류수에 적신 티슈로 감싼다.
3. 수분이 날아가지 않게 크린랩으로 밀봉하여 통에 담아 4°C 냉장고에 보관한다.
4. 라벨링한다. 15well, 3ea, 12%(acrylamide), date

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[4] Gel Documentation System 준비하기

1. Casting Stand / Frame 장비 조립하기

① 왼쪽(빨강), 오른쪽(검정) 전극 색상에 맞춰서 틀(Bio-RAD)을 놓는다.

② 좌우를 맞춰 겔 지지대에 gel을 양면으로 끼우고 닫는다.

③ 조립된 겔 지지대를 큰 통에 넣는다.

 

2. Running Buffer 채우기

① 지지대 내부를 먼저 채우고, 나머지는 바깥쪽에 부어서 높이차를 만든다.

② 5분 정도 기다리며 높이차가 줄어들지 않는지 확인한다 (틈으로 buffer가 새면 loading 시 라인이 비뚤어지므로 주의해야 한다).

Running Buffer 성분표!
!!!!!! 아마 여기에 SDS가 든 것 같다.

 

3. Loading Sample 채워 넣기

① Comb를 수직으로 들어 올려 조심스럽게 제거한다.

② Syringe Tip을 사용하여 B.I & A.I cell pellet은 6λ씩, 그 외 단백질과 ladder는 8λ씩 loading 한다. (피펫팅 시 one-stop 또는 two-stop 여부에 따른 오차를 주의한다. 사수님은 one-stop 권장, two-stop은 기포 발생 우려 때문).

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[5] Electrophoresis Run

1. Setting 하기

① 뚜껑을 닫고 전압을 연결한다.

② 전극 선이 달린 뚜껑을 빨/검은색에 맞게 닫는다.

③ 기기를 180V, 60min으로 설정한 후 run 버튼을 누른다. ( 사수님 팁 : 23℃와 18℃ 샘플이 대칭이라 헷갈릴 수 있으므로, 구분을 위해 이후 gel 끝을 찢어서 표시한다.)

2. 뒷정리

① 사용한 buffer는 재사용을 위해 깔때기를 이용해 유리병에 다시 담는다.

② 지지대 몸통을 수세미(부드러운 면)로 닦는다. 지지대의 나사 부분은 잘 마르도록 air-gun으로 말려준 후 걸어서 건조한다.

③ 유리판은 손 또는 킴테크로 기스나지 않게 닦는다 (퐁퐁 사용).

④ 70% 에탄올을 분사하여 마무리한다.

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[6] 염색 후 촬영

1. Staining (염색)

① EZ-gel(염색액)을 보관통에 붓는다.

③ Gel의 오른쪽 끝을 자르고(잘 찢어지므로 유의), 물에 띄워 EZ-gel 보관통에 옮긴다.

④ Shaker에서 15분간 기다린다 (오래 두면 안 됨).

 

2. 촬영

① 물로 gel을 헹궈낸다.

② Bio-RAD 기기에 gel을 잘 펼쳐 놓는다.

③ 사진 촬영을 진행한다.

④ 사용한 EZ-gel은 재활용한다.

EZ-gel 은 빛에 민감하므로 amber tube (검은색 시약통) 등에 보관해야 한다.

3. 실험 결과 확인 및 기록

• 결과: mCherry만 뜨고 GFP는 뜨지 않음.
• 후속 연구 : 추가 gene sequence 확인 필요!